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大家好，今天分享一篇发表在Nature Communications的文章“Spatiotemporal and direct capturing global substrates of lysine-modifying enzymes in living cell“，通讯作者为中国科学院上海药物研究所的陈小华研究员；课题组主要进行蛋白质相互作用和蛋白质稳态调控研究，结合药物化学、有机化学、分子及细胞生物学、蛋白质工程、化学蛋白质组学等多学科交叉手段和多种新兴技术，开展蛋白质间相互作用和靶标确证研究、基于靶向蛋白降解技术的创新药物研发等。

背景：

翻译后修饰是指蛋白经核糖体合成后氨基酸残基上发生的共价化学修饰，其中大部分翻译后修饰都需要酶的参与。翻译后修饰对于调控蛋白的功能十分重要，翻译后修饰状态的失调可以导致多种复杂的疾病。因此，准确表征翻译后修饰相关酶和底物之间的关联变得十分重要。目前常见的分析策略为以底物为中心来识别相应的蛋白质修饰酶，例如基于PTM 修饰底物替代物的化学蛋白质组学，蛋白（肽段）微阵列，以及免疫共沉淀等方法。目前酶和底物的相互作用分析通常在体外进行，存在多种不足。例如无法模拟复杂动态的原生细胞环境，很难捕获弱和瞬时相互作用底物。基于以上考虑，研究人员开发了一种在活细胞体内直接捕获翻译后修饰酶底物的化学交联方法，实现了翻译后修饰酶的全局分析和修饰位点的直接分析 。

关键数据：

11. 翻译后修饰酶底物的捕获策略设计

化学交联技术被广泛应用与蛋白与蛋白的相互作用，作者受此启发，希望通过集合化学交联技术和翻译后修饰的共价结合过程，来直接分析活细胞中的酶底物。作者在本文中选择了蛋白赖氨酸残基上的酰化修饰作为研究对象。作者首先使用了一种非天然氨基酸（Uaa）o-硝基苯醇衍生的赖氨酸（o-NBAK）作为光交联剂，其可以在光照下和其它赖氨酸特异性的高效结合。通过在酶的催化口袋中嵌入o-NBAK，将以高灵敏度和精度，以空间和时间控制的方式捕获相互作用底物上发生酰化修饰的赖氨酸残基。

2. 蛋白质组表征赖氨酸乙酰转移酶 PatZ的直接底物

研究者们在大肠杆菌中对PatZ酶进行了分析。PatZ及其同源酶是细菌中主要的赖氨酸乙酰转移酶，调控多种生物过程，包括生长、运动性、应激反应等，但对应的酰化底物仍然难以捉摸。因此，PatZ及其同源酶显示出除乙酰化外的多样性酰化活性。实现PatZ酶的底物分析，首先需要找到引入o-NBAK的适当位点，由于目前没有可用的晶体结构，作者对PatZ的催化结构域进行了同源建模。选择了PatZ中的三个位点（I800，F810，L813）用于引入o-NBAK Uaa。发现在I800和L813位点引入o-NBAK的PatZ突变体能够实现良好的化学交联效果，其在远离催化口袋的位置（S816）引入o-NBAK Uaa没有观察到蛋白的化学交联。该结果证明了该策略的空间分辨率特征（图3）。然后作者分别使用质谱和WB的手段对鉴定的PatZ潜在底物和乙酰化位点进行了验证来证明结果的可靠性。

3. 光催化化学交联捕获翻译后修饰酶底物方法的适用性

在对PatZ底物成功分析的基础上，作者将此策略成功应用到了其它酶上，包括细菌中的YiaC、LplA、TmcA、YjaB酶 （图4）和哺乳动物中的Tip60和GCN5酶。结果表明不同尽管这些酶都是乙酰化修饰酶，但是它们的直接作用的底物却存在很大的差异。

总结：

直接捕获PTM-酶底物的策略为活细胞中的PTM-酶全局底物分析提供了一个新的化学工具，大大扩展了PTM-酶的底物谱。这种策略具有高度的残基选择性、空间时间分辨率、可以实现共价捕获，使得以更高的灵敏度和准确度解码底物成为可能，同时也能直接验证底物的酰化位点。直接捕获PTM-酶底物的概念可能会激发并引领基于其他种类的残基选择性交联化学的先进捕获策略的进一步发展，扩展对其它翻译后修饰类型的研究。